نقش ژن نورآمینیداز در بیولوژی ویروس آنفلوانزا

نوع مقاله: گزارش

نویسندگان

گروه دامپزشکی، دانشکده کشاورزی، واحد شوشتر، دانشگاه آزاد اسلامی، شوشتر ایران

چکیده

نور آمینیداز جز گلیکوپروتئین های کلاس II است که انتهای آمینی آن در داخل ویریون و انتهای کربوکسیل آن در خارج قرار دارد. این گیلکوپروتئین توسط قطعه شش RNA کد می شود. این ژن حدود 1413 نوکلئوتید طول دارد و پروتئین حاصل از آن از 453 آمینواسید تشکیل شده است. عموما به ازای هر یک ملکول نورآمینیداز (NA ) در سطح ویروس پنج مولکول هماگلوتینین (HA ) قرار دارد اما  این نسبت بین تحت تیپ های ویروس متفاوت است نورآمینیداز (NA ) دومین گلیکوپروتئین مهم در ویروس های آنفلوانزای نوع A,B می باشد یازده تحت تیپ NA در ویروس های آنفلوانزای نوع A وجود دارد که برحسب مقایسه سکانس در دو گروه قرار دارد. هیچ تحت تیپی در ویروس های آنفلوانزای نوع B شناخته نشده که این احتمالا به دلیل نداشتن میزبان مخزن در بین حیوانات است. نورآمینیداز 5 تا 10 درصد کل پروتئین ویروس را شامل می شود و نقش مهمی در بیولوژی ویروس آنفلوانزا دارد لذا در این مقاله سعی شده است که به اهمیت و نقش این پروتیئن پرداخته شود

کلیدواژه‌ها


اولین شواهد حضور آنزیم نورآمینیداز در ویروس آنفلوانزا بوسیله هرست  در سال 1942 کشف شد. او گلبول های قرمز را با ویروس آنفلوانزا در گرمخانه (incubation ) مجاور کرد و مشاهده نمود که واکنش هماگلوتیناسیون پس از مدتی از بین می رود (5). در این آزمایش ساده یکی از دو گلیکوپروتئین سطحی ویروس آنفلوانزا یعنی هماگلوتینین بوسیله گلیکوکونژوگه های حاوی اسید سالیک موجود در سطح گلبول قرمز به آن متصل می شود و گلیکوپروتئین دیگر یعنی نورآمینیداز به صورت اختصاصی اسید سیالیک را از گلیکوکونژکه ها آزاد می کند. نورآمینیداز خار گلیکوپروتئینی روی ذره ویروسی به صورت یک تترامر می باشد که از چهار منومر یکسان تشکیل شده است نورآمینیداز ویروس های آنفلوانزای نوع A دارای یک دم داخل سیتوپلاسمی بسیارمحافظت شد و یک ناحیه آب گریز داخل غشایی است که بعنوان لنگری برای قسمت های خارج غشایی ،ساقه (stalk  ) سر (Head ) عمل می کند.نورآمینیداز یک پروتئین قارچی شکل است که از چهار تحت واحد مشابه تشکیل شده است (2). این پروتئین یک سر جعبه مانند به ابعاد A 60×100×100 دارد که روی یک ساقه نازک قرار گرفته است. وزن مولکولی هر یک از مونومرهای مولکولهای نورآمینیداز 68-58 کیلودلتن است. چهار مونومر مولکول نورآمینیداز بوسیله پیوندهای دی سولفید به هم متصل شده و تشکیل تترامر می دهند (8). این تحت واحدها کروی بوده و با تقارن دایره ای چیده شده اند شکل (1-6) ساختار هر یک از ساختار چین خورده پروتئین نورآمینیداز سبب شده است که تعداد نسبتا زیادی از آمینواسیدهای باردار از نظر شکل فضایی در کنار هم قرار بگیرند و این آمینواسید ها در تمام سویه های ویروس آنفلوانزا تیپ A,B مشابه اند. این آمینواسیدها دیواره ها و اطراف یک حفره یا شیار عمیق رادر سطح پروتئین تشکیل می دهند که محل اتصال و قرار گرفتن اسید سیالیک و آنالوگ های آن است و محل فعال آنزیمی پروتئین نورآمینیداز به شمار می رود.

 

 

شکل (1-7) چهار مونومر مولکول نورآمینیداز که  بوسیله پیوندهای دی سولفید به هم متصل شده اند

 

 

. این جایگاه در مولکول نورآمینیداز در موقعیت های 118  Arg ، Glu119 ، Asp151 ، Asp198 ، Arg224 ، Glu227 ، Arg292 ، Asp330 ، lys350 ، Glu425 می باشد و جایگاه های نزدیک و دخیل در جایگاه فعال عبارتند از :leu134،try121. (3).در محل فعال آنزیمی

  شبکه ای متشکل از سه اسید آمینه آرژنین در موقعیت های 118،292،371 وجود دارد که گروه کربوکسیلات اسید سیالیک متصل شده را احاطه کرده ودر ایجاد حالت (قایق)  جایگاه فعال آنزیمی در زمان اتصال به اسید سیالیک نقش دارد و این حالت برای فعالیت کاتالیزوری ضروری است (3).الگوی جایگاه های گلیکوزیلاسیون در مولکول های مختلف نورآمینیداز مشابه بوده است و عبارت است از N-X-T/S که X هر اسید آمینه ای به جز پرولین می تواند باشد این جایگاه عبارت است از آسپارژین در جایگاه های 61،69،146،200،234،402 تنها تفاوت بین ویروس های H9N2 انسان و پرندگان و ویروس های H3N2 انسان وجود جایگاه گلیکوزیلاسیون اضافی در جایگاه آسپارژین 329 در ویروس های انسانی است (9). مطالعات انجام شده روی ساختار مولکول نورآمینیداز در ویروس های آنفلوانزای تیپ A,B نشان داده است که شکل کلی چین خوردگی پروتئین نورآمینیداز در تحت تیپ های مختلف یکسان است اگر چه مواردی از حذف واضافه شدن آمینواسیدها یامحل های گلیکوزیلاسیون در مولکول نورآمینیداز در تحت تیپ های مختلف دیده می شود (3).قسمت ساقه به طور معمول از حدود 50 آمینواسید تشکیل شده است که حدودا از جایگاه آمینواسیدی 40 از انتهای N پروتئین شروع می شود . ساقه نورآمینیداز حداقل یک جایگاه آمینواسیدی سیستین (پیوند دی سولفید ) دارد .نورآمینیداز ویروس آنفلوانزا بوسیله یک دامین هیدروفوبیک سیگنالی – لنگری به طول 29 اسید آمینه در انتهای آمینی به غشای دو لایه لیپیدی متصل می شود جالب اینکه اغلب گلیکوپروتئین های غشای ویروسی وسلولی از انتهای کربوکسیل خود به غشا متصل می گردند (1). به نظر می رسد خاصیت هیدروفوبی این ناحیه از توالی آن در القای نقش خاصی که دارد مهمتر است. با این حال تعداد جایگاه آمینواسیدی در این ناحیه که بلافاصله بعد از ناحیه دم سیتوپلاسمیک قرار دارندنسبتا حافظت شده است (3).

 

1-3-2-1 عملکرد آنزیم نور آمینیداز :


گلیکوپروتئین نورآمینیداز اسیدسیالیک را از گیرنده های سطحی سلول میزبان و هماگلوتینین بارزشده در سطح ویروس ها یا سطح سلول های آلوده برمی دارد (14). هنگامی که عملکرد نورآمینیداز بوسیله آنتی بادی های مهار کننده مختل شود و یا هنگام کشت ویروس های موتانت فاقد نورآمینیداز که به صورت کامل یا ناقص فعالیت نورآمینیداز خود را از دست داده باشند مشاهده می شودکه ذرات ویروسی به همدیگر یا به سطح سلول می چسبند و با اضافه کردن نورآمینیداز اگزوژن به محیط کشت در این شرایط از شکل گیری تجمع ویروسی ذکر شده ممانعت می شود. بنابراین به نظر می رسد که عمل اصلی نورآمینیداز در ویروس آنفلوانزا ممانعت از تجمع ویروس ها با جدا کردن اسید سیالیک از سطح ویروس و کمک به رها کردن ویروس ها از سلول آلوده با جدا کردن اسیدسیالیک از هماگلوتینین ویروس در سطح سلول است (12). از آنجای که مهارنورآمینیداز منجر به تاخیر در آزاد شدن ویروس های تولید شده از سطح سلول آلوده می شود میزان ویروس کاهش یافته،و سیستم ایمنی فرصت کافی برای حذف ویروس خواهد داشت . به همین دلیل نورآمینیداز گزینه خوبی برای طراحی داروهای ضد آنفلوانزا است (14). اگر چه برخی مطالعات نقش نورآمینیداز را صرفا محدود به رهاسازی ذرات ویروس از سطح سلول های میزبان یا تجمع های ویروسی می دانند. مطالعات دیگر نقش های دیگری برای نورآمینیداز درچرخه عفونت و فرآیند مونتاژ ویروس قائل هستند (12). به نظر می رسد نورآمینیداز در نفوذ ویروس آنفلوانزا در ترشحات مخاطی (موسین ) مملو از اسید سیالیک نقش داشته باشد و به ویروس کمک می کند تا از اپیتلیوم تنفسی عبور کرده و به سلول های هدف برسد (4).شواهد مختلفی از دخیل بودن نورآمینیداز در القا آپوپتوزیس یا مرگ برنامه ریزی شده سلولی وجود دارد چرا که نورآمینیداز باعث فعال شدن TGF-β می شود که یک القا کننده مرگ سلولی در سلول های پوششی است و از طرفی ترکیبات ضد نورآمینیداز بطور نسبی باعث از بین رفتن آپوپتوزیس در سلول های MDCK آلوده به ویروس آنفلوانزا بدون تاثیر روی تعداد سلول های آلوده می شود (11).عملکرد دیگر پروتئین نورآمینیداز وجود فعالیت همادسوربشن  در آن است در واقع گلیکوپروتئین نورآمینیداز (NA ) دارای سه جایگاه همادسوربشن (HB ) است که در جایگاه های 373-366،404-399،433-431 قرار دارد مهار فعالیت نورآمینیداز با آنالوگ اسید سیالیک و برخی از آنتی بادی ها اثری روی فعالیت (HB ) آن نداشته اند (10).نتایج مطالعات مختلف نشان می دهد که احتمالا جایگاه همادسوربشن در پروتئین نورآمینیداز در جایگاهی متفاوت نسبت به جایگاه های فعال آنزیمی قرار دارد (3).تحت تیپ های دارای فعالیت HB قادرند گلبول های قرمز ماکیان و انسان رادر دمای 4 درجه سانتی گراد آگلوتینه کنند (7). اگر چه در مورد تحت تیپ N9 فعالیت HB در محلول PBS تا دمای 37 درجه سانتی گراد دوام می یابد  .خاصیت HB در اغلب تحت تیپ های نورآمینیداز ویروس های آنفلوانزای پرندگان آبزی و اسب دیده می شود  اما در ویروس های آنفلوانزای جدا شده از انسان و خوک اغلب مقادیر ضعیفی از خاصیت HB دیده می شود که حاکی از تغییر در توالی آمینواسید های مرتبط با این خاصیت در این ویروس ها است (13). با توجه به وجود خاصیت HB در اغلب ویروس های آنفلوانزای طیور و اسب ممکن است این خاصیت نقش بیولوژیک مهمی در تکثیر و دوام ویروس در این میزبان ها داشته باشد.از طرف دیگر ممکن است که محل HB در ساختار مولکول نورآمینیداز در میزبان جدید انسان در این ویروس تغییر کرده باشد به طوری که توانایی ارتباط ویروس با یک مولکول متفاوت را در میزبان جدید فراهم کرده باشد و این توانایی اتصال به مولکول جدید دیگر با آزمایش اتصال به R.B.C جوجه ها قابل تشخیص نباشد. . بس و همکاران نشان دادند که انتهای آمینی هیدروفوبیک بین غشایی پروتئین نورآمینیداز علاوه بر نقشی که در اتصال کل مولکول به غشای ویروس و سلول دارد (نقش لنگر) بعنوان یک سیگنال عمل کرده و قادر است پروتئین هماگلوتینین فاقد سیگنال را به شبکه آندپلاسمیک خشن منتقل کند از این رو ناحیه هیدروفوبیک انتهای آمینی را دامین سیگنالی – لنگری می نامند (1).اهمیت ناحیه دم سیتوپلاسمی می تواند در ارتباط سلول میزبان واجزای ویروس ونهایتا مونتاژ ویروس باشد. از آنجای که عملکرد نورآمینیداز در ویروس های آنفلوانزای نوع A,B مشابه است و جایگاه های فعال موثر در این عملکرد بسیار محافظت شده است امکان تاثیر ممانعت کننده های نورآمینیداز در حد وسیع وجود دارد نورآمینیداز مثل هماگلوتینین یک مولکول آنتی ژنتیک است ودارای سویه های متعدد در طبیعت می باشد . معمولا آنتی بادی هایی که بر علیه نورآمینیداز تولید می شود خنثی کننده نیستند ولی مشخص شده ایمنی زایی با نورآمینیداز یک روش حد واسط است که امکان آلودگی را فراهم می کند ولی باعث کاهش بیماری می شود .شواهد مختلفی از دخیل بودن نورآمینیداز در القا آپوپتوزیس یا مرگ برنامه ریزی شده سلولی وجود دارد چرا که نورآمینیداز باعث فعال شدن TGF-β می شود که یک القا کننده مرگ سلولی در سلول های پوششی است و از طرفی ترکیبات ضد نورآمینیداز بطور نسبی باعث از بین رفتن آپوپتوزیس در سلول های MDCK   آلوده به ویروس آنفلوانزا بدون تاثیر روی تعداد سلول های آلوده می شود (11).عملکرد دیگر پروتئین نورآمینیداز وجود فعالیت هما دسوربشن در آن است در واقع گلیکوپروتئین نورآمینیداز (NA ) دارای سه جایگاه همادسوربشن (HB ) است که در جایگاه های 373-366،404-399،433-431 قرار دارد مهار فعالیت نورآمینیداز با آنالوگ اسید سیالیک و برخی از آنتی بادی ها اثری روی فعالیت (HB ) آن نداشته اند (10).نتایج مطالعات مختلف نشان می دهد که احتمالا جایگاه همادسوربشن در پروتئین نورآمینیداز در جایگاهی متفاوت نسبت به جایگاه های فعال آنزیمی قرار دارد (3).تحت تیپ های دارای فعالیت HB قادرند گلبول های قرمز ماکیان و انسان رادر دمای 4 درجه سانتی گراد آگلوتینه کنند (7) اگر چه در مورد تحت تیپ N9 فعالیت HB در محلول PBS تا دمای 37 درجه سانتی گراد دوام می یابد  .خاصیت HB در اغلب تحت تیپ های نورآمینیداز ویروس های آنفلوانزای پرندگان آبزی و اسب دیده می شود  اما در ویروس های آنفلوانزای جدا شده از انسان و خوک اغلب مقادیر ضعیفی از خاصیت HB دیده می شود که حاکی از تغییر در توالی آمینواسید های مرتبط با این خاصیت در این ویروس ها است (13). با توجه به وجود خاصیت HB در اغلب ویروس های آنفلوانزای طیور و اسب ممکن است این خاصیت نقش بیولوژیک مهمی در تکثیر و دوام ویروس در این میزبان ها داشته باشد.از طرف دیگر ممکن است که محل HB در ساختار مولکول نورآمینیداز در میزبان جدید انسان در این ویروس تغییر کرده باشد به طوری که توانایی ارتباط ویروس با یک مولکول متفاوت را در میزبان جدید فراهم کرده باشد و این توانایی اتصال به مولکول جدید دیگر با آزمایش اتصال به R.B.C جوجه ها قابل تشخیص نباشد.